В статье приведен сравнительный анализ физиологических свойств фитопатогенной микрофлоры грибной и бактериальной природы и выдвинуто предположение, что с большой долей вероятности проникновение бактериальной микрофлоры в растение происходит на фоне заражения его грибной микрофлорой. В соответствии с этой теорией наиболее эффективным средством борьбы с бактериозами должны быть препараты, обладающие одновременно бактерицидными и фунгицидными свойствами . Приведены основные этапы разработки препарата Бинал Экстра и проверка его эффективности в различны технологиях биологической защиты.
Принципы работы
Фитопатогенная микрофлора представлена двумя группами микроорганизмов: эукариотами (грибная микрофлора) и прокариотами (бактериальная микрофлора). Несмотря на глобальное преобладание видов грибных микроорганизмов над бактериальными, в последнее время все большую озабоченность вызывают болезни растений, вызванные именно бактериями.
Физиология развития и роста у бактерий и грибов различна, особенно это проявляется в прикорневой зоне растений, где кроме самих корней еще присутствует и твердая фаза в том или ином виде. Рост микроорганизмов в прикорневой зоне возможен только за счет метаболизма экссудатов корневой системы. Состав экссудатов для различных растений на разных стадиях развития различен, чем, собственно, и объясняется многообразие микрофлоры в прикорневой зоне растения Скорость потребления экссудатов различными микроорганизмами разная, и, что более важно, экссудаты у разных микроорганизмов потребляются до разных конечных концентраций. Грибы способны к метаболизму экссудатов при их крайне низких концентрациях, в то время как многие бактерии не способны метаболизировать экссудаты при остаточных концентрациях, оптимальных для грибов. Грибные микроорганизмы, как правило, в природе растут на поверхности раздела фаз: твердой и жидкой, жидкой и газообразной, а для клеток бактерий более характерно планктонное состояние, хотя образование пленок на поверхностях тоже возможно.
Важной характеристикой колонизации ризосферы растения является способность микроорганизмов к ориентации в прикорневой зоне и колонизация оптимальных зон для развития. Практически все грибы обладают способностью к направленному росту в сторону наиболее благоприятную для этого. Положительными моментами следует признать увеличение концентрации субстрата, или снижение концентрации ингибиторов, выделяющихся растением. Иными словами, грибы всегда растут в сторону корня и (или) кислорода из воздуха. Линейная скорость, ориентированного роста грибов может достигать нескольких миллиметров в сутки, а рассчитанный нами градиент концентраций, на который они способны реагироват,ь может составлять микрограммы на длину мицелия. Бактерии обладают механизмом хемотаксиса, движения в наиболее благоприятную для них сторону, за счет вращения жгутиков. Направленное движения у бактерий при этом затруднено броуновским движением, а самое главное отсутствием в грунте «свободной» (гравитационной) воды. Расчетные данные по хемотаксису для бактерий показали, что с учетом фактора броуновского движения, клетка перемещается в среднем на 20 -30 собственных длин за сутки, что на порядки ниже скорости направленного роста грибов. Это еще один фактор влияющий на формирование микробногоценоза в прикорневой зоне. «Свободная» вода в данном контексте - это вода, которая в данной системе не подвержена капиллярному эффекту. В воде, в которой могут свободно перемещаться микроорганизмы, и проходит растворение органических и неорганических компонентов. Грибы, как правило, растут в капиллярной воде, а бактерии, в большей степени, в гравитационной. И это еще один фактор, определяющий формирование ризобиальной микрофлоры. Соотношение гравитационной и капиллярной воды в современных субстратах для гидропонного выращивания растений сдвинуто в сторону последней.
Состав ферментативных активностей литических ферментов как у грибов, так и у бактерий крайне разнообразен и во многом схож. Практически все почвенные микроорганизмы выделяют пектиназы, целлюлазы, амилазы, протеиназы и даже липазы, но в случае грибов выделение ферментов происходит тогда, когда клетки сорбированы на поверхности (в том числе и корня) и, соответственно, эффективность взаимодействия одного из активных центров целлюлаз (центра связывания с субстратм) в этом случае выше, чем у фермента, секретируемого в водный раствор, как для случая планктонных клеток.
Основной особенностью фитопатогенных грибов по отношению к объекту воздействия (растению) является наличие механизма синтеза низкомолекулярного небелкового токсина. Синтез токсина осуществляется грибами (на примере Fusarium oxysporum) на поздних стадиях своего развития и его роль в общем метаболизме клеток не совсем ясна. Но низкомолекулярный токсин взаимодействует с корневой системой растения, подавляя или снижая защитные функции растения. Для ризобиальных форм бактерий, в том числе и для фитопатогенных, пока нет четко установленных низкомолекулярных соединений, оказывающих токсическое действие на растение.
Таким образом, общий анализ физиологии развития фитопатогенных форм грибов и бактерий указывает на то, что, скорее всего, бактериозы проявляются у растений только в том случае, если оно (растение) было атаковано фитопатогенным грибом и одновременно в него попали и фитопатогенные бактерии. При нахождении грибов и бактерий одновременно в растении их физиология развития различна: гриб продолжает ориентированный направленный рост по сосудам растения, а бактерии достаточно быстро разносятся по всему растению, при этом пектолитические ферменты бактерий способствуют этому. В соответствии с теорией фитопатогенеза, даже пораженное растение способно к выработке механизмов защиты и локализации грибных заболеваний, а вот бактериальные возбудители, которые распространились по всему растению, локализовать практически невозможно, хотя подавление их ферментов растению вполне по силам. Таким образом возможна и реализуется передача бактериальной инфекции через семена. Применение химических фунгицидных препаратов только способствует распространению бактериозов, так как химические препараты, как правило, применяются по факту диагностики грибной инфекции. Подавление бактериозов химическими обработками малоэффективно, так как данные методы не позволяют пролонгировано регулировать численность бактерий.
Проведение исследования
В связи с этим, нами была поставлена задача разработки технологии биологической защиты против бактериозов на основе общей теории фитопатогенеза. Для этого мы постарались решить следующие вопросы:
- подобрать микроорганизмы, отвечающие следующим требованиям:
- подобрать микроорганизмы, отвечающие следующим требованиям:
- обладать способностью подавлять развитие фитопатогенных прокариотических микроорганизмов различной природы как граммположительных, так граммотрицательных;
- должны как можно дольше сохранять свои свойства в ризосфере защищаемых растений;
- не должны оказывать фунгицидного действия, на агентов биологического контроля, в том числе Trichoderma viride.
- создать препарат на основе данных микроорганизмов.
- разработать технологию защиты от бактериозов.
В качестве объекта исследований на основе литературных данных и собственных исследований, проведенных ранее, была выбрана группа молочнокислых микроорганизмов. Всего было исследовано 7 микроорганизмов из собственной коллекции ООО "БИОМ-ПРО" и из коллекции ВКПМ.
Антагонистическую активность по отношению к Грам (+) и (-) микроорганизмам определяли методом «Диффузии в агар». Для этого на твердой агаризованной средой L-агар, проделывали по 4 лунки на равном отдалении друг от друга кольцами Рашига. На поверхность агаризованной среды высевали газоном тест культуры – Agrobacterium sp., Erwinia sp.,Pseudomonas sp.,Bacillus sp. В лунки помещали культуральную жидкость c клетками исследуемых молочнокислых микроорганизмов объемом по 100 мкл, в остальные лунки помещали стерильную воду и антибиотик широкого спектра действия – амоксициллин в концентрации 0,1 г/мл в количестве 100 мкл., стерильным кольцом Рашига диаметром 7 мм делали лунки, в которые помещали суспензию исследуемого микроорганизма. По размерам зоны просветления определяли наличие способности к подавлению развития бактерий. По результатам этих исследований была отобрана группа микроорганизмов, обладающая ярко выраженными антагонистическими свойствами
Так как, на синтез низкомолекулярных соединений у молочнокислых микроорганизмов существенную роль оказывает состав питательной среды, то аналогичные исследования были проведены на агаризованных средах, где в качестве источника углерода нами использовались органические соединения, моделирующие экссудаты, выделяемые огурцом, в концентрациях, близких к реальным. Часть исследуемых микроорганизмов проявила свойство подавления роста исследуемых бактерий и на средах с моделями экссудатов корневой системы. На Рисунке №1 представлены результатыподавления Agrobacteriumsp.
<Таблица>Для проведения теста на фитотоксичность использовали стандартные методы по проращиванию семян огурца во влажной камере в присутствии суспензии исследуемых молочнокислых микроорганизмов. Результаты, представленные в Таблице 1, показывают, что ни один из исследуемых микроорганизмов не оказывает фитотоксического действия на прорастание семян огурца.
Высевы с поверхности корневой системы проростков огурца доказывают, что молочнокислые микроорганизмы способны к росту на его поверхности, а, следовательно, к метаболизму экссудатов, не оказывая отрицательного воздействия на развитие растения (Рисунок 2.)
На этом этапе для дальнейшей работы был отобран один штамм микроорганизмов, обладающий наибольшей способностью к подавлению фитопатогенов.
Для проверки элиминирования молочнокислых микроорганизмов из ризосферы корневой системы огурца, нами были проведены исследования, в ходе которых в растущие в торфяном субстрате огурцы однократно вносили суспензию молочнокислых микроорганизмов и далее в течении 2-х месяцев отбирали пробы торфа из глубины горшков и анализировали в них наличие молочнокислых микроорганизмов. Результаты анализов, представленные в Таблице 2, доказывают, что молочнокислые микроорганизмы, привнесенные в ризосферу корневой системы огурца, сохраняются как минимум 2 месяца.
<Таблица>Исследования взаимного влияния гриба Trichoderma viride и молочнокислых микроорганизмов проводили стандартными методами на стандартных средах и на средах, моделирующих экссудаты корневой системы огурца.
Как видно на Рисунке 3 два микроорганизма не оказывают отрицательного воздействия на развитие друг друга
