Технологии
Иммобилизация микроорганизмов как способ повышения стабильности и эффективности биологических препаратов
20 августа 2020, 12:23
Журнал Гавриш №1, 2012
В настоящее время химические пестициды — наиболее востребованный инструмент в защите растений. Однако их токсичность для окружающей среды, персонала тепличных комбинатов и, конечно же, потребителя с.-х. продукции общеизвестна и вызывает серьезную озабоченность в обществе. Введение Европейским Союзом ограничений на использование химических пестицидов в тепличных хозяйствах стимулировало поиск альтернативных методов борьбы с вредными для растений организмами.
Принципы работы
Одним из таких методов стало применение биологических препаратов, которые, в отличие от химических, безвредны для окружающей среды и живых организмов. Систематический мониторинг в тепличных хозяйствах показал, что для предотвращения потерь, вызываемых вредными организмами, и получения экологически безопасной продукции, необходимо внедрять методы биологической защиты. В некоторых тепличных комбинатах реализуется идея полного отказа от применения средств химической защиты или, по крайней мере, преимущественное использование биометода. Поэтому весьма актуальны исследования, направленные на поиск новых, экологически безопасных, экономичных средств защиты растений, обеспечивающих сохранение урожая и потребительских качеств продукции. В этой связи необходимо создание эффективных отечественных биопрепаратов, подавляющих развитие микроорганизмов, колонизирующих растение, и ингибирующих выделение этими микроорганизмами токсинов. Существующий ассортимент биопрепаратов ежегодно пополняется, при этом совершенствуются их качество и появляются новые препаративные формы.
В зависимости от препаративной формы, биологические препараты, присутствующие на современном рынке, делятся на три группы:
- жидкие — клетки микроорганизмов в культуральной жидкости или стабилизирующем растворе;
- сухие — порошки, таблетки, гранулы;
- иммобилизованные — гранулы с заключенными внутри клетками микроорганизмов, в консервирующем растворе.
Жидкие препаративные формы
Жидкие препаративные формы представляют собой культуральную жидкость клеток, концентрат или клетки микроорганизмов, помещенные в стабилизирующий раствор. В культуральной жидкости сохраняются компоненты, которые служат источником питания как для полезных микроорганизмов, так и для фитопатогенов. Кроме того, при фасовке жидких препаратов существует вероятность занесения посторонней микрофлоры, которая не всегда безобидна для растений. При хранении препаратов (особенно неправильном) может начаться вторичный рост микроорганизмов и посторонней микрофлоры, что обычно приводит к резкому снижению биологической активности препарата. Активность некоторых препаратов, выпускаемых в жидком виде, при хранении в течение двух-трех недель снижается в несколько раз. А развитие посторонней микрофлоры может сделать препарат не безвредным для применения в теплицах и привести к непредсказуемым результатам.
Эффект после применения жидких биопрепаратов на основе Bacillus subtilis сохраняется в течение недели, после этого бациллы могут присутствовать в субстрате, но работать не будут. Это напрямую связано с физиологией развития бактерий рода Bacillus — максимальный выброс метаболитов, за счет которых и наблюдается защитный эффект, происходит в момент прорастания спор. Поэтому для данного микроорганизма такая форма хранения оправдана: при использовании жидкой суспензии спор Bacillus subtilis споры прорастают дружно (в течение 4-8 ч), тем самым максимально увеличивая концентрацию метаболитов, а значит, эффективность препарата высокая. Поскольку вегетативные клетки B. subtilis в процессе метаболизма антибиотики практически не выделяют и препараты на основе B. subtilis не обладают пролонгированным действием, то дружность прорастания спор для данного микроорганизма особенно важна. Это практические единственный плюс жидкой препаративной формы для биопрепаратов.
Жидкие препараты на основе грибных клеток микроорганизмов слабо стабильны при хранении в силу физиологических особенностей клеток спор и грибов. После внесения полезные микроорганизмы не всегда способны адаптироваться к реальным условиям окружающей среды и оказаться конкурентоспособными в борьбе за свободные ниши с аборигенной микрофлорой. Так, препараты на основе клеток гриба Paecilomyces lilacinus (для борьбы с галловой нематодой) практически сразу погибают после внесения в субстрат. Этот препарат не стабилен и при хранении.
Сухие препаративные
Сухие препаративные формы биопрепаратов более устойчивы при хранении. Это обусловлено тем, что для их производства используют не сами вегетативные клетки микроорганизмов, а их споры. В идеальных условиях (отсутствие примесей, постоянная температура, минимальная или постоянная влажность, герметично закрытый объем) сухие споры могут храниться достаточно долго.
Реальные биологические препараты представляют собой, кроме спорового материала, смесь различных компонентов — остатков питательной среды, солей, наполнителей, прилипателей, эмульгаторов. Остаточная влажность в таких препаратах составляет 5-10%. Все это снижает устойчивость спор при хранении. Наши исследования сухой препаративной формы на основе бактерий Bacillus subtilis показали, что концентрация жизнеспособных спор снижается в течение первых трех месяцев в 10 раз, а в дальнейшем за год — в 1000 раз. Это необходимо учитывать при разработке технологий применения сухих препаративных форм биологических препаратов.
Хуже обстоят дела с сухими биопрепаратами, полученными на основе вегетативных клеток или спор грибов. В силу своей физиологии споры грибов менее устойчивы, чем споры бактерий. Наши исследования по хранению препаратов на основе спор грибов рода Trichoderma показали, что концентрация жизнеспособных спор в препарате в течение трех месяцев снизилась в 20-25 раз, а за год концентрация жизнеспособных спор упала до значений 103.
При использовании сухих форм не стоит доверять параметрам, декларируемым производителями — исходной концентрации и остаточной влажности. Оба эти параметра могут существенно варьировать не по вине производителя, а за счет того, что после выпуска препарата до его применения проходит время.
Единственным выходом в данной ситуации при применении сухих препаративных форм в теплицах является самостоятельное определение их концентрации и перерасчет доз применения, исходя из полученных результатов.
Иммобилизация микроорганизмов
Совершенно иной методологический подход заложен в препаратах на основе иммобилизованных клеток. Иммобилизация микроорганизмов — это процесс закрепления клеток на поверхности или в объеме носителя.
Известно, что клетки, иммобилизованные на носителе или в его массе, менее подвержены отрицательному действию окружающей среды (свет, температура, осмотическое давление, рН среды), чем свободные клетки микроорганизмов. Это достигается за счет диффузионных ограничений, которые возникают между иммобилизованными клетками и окружающей средой. Клетки микроорганизмов в иммобилизованном состоянии помещены в микрогранулы или на кристаллический носитель и покрыты оболочкой, что защищает их от внешних воздействий. Метаболические процессы внутри клеток из-за отсутствия кислорода резко заторможены. Замедление процессов жизнедеятельности обусловлено также и применением консервирующих растворов.
Безусловно, часть клеток гибнет и при хранении в иммобилизованном состоянии, и концентрация биопрепарата снижается. Принципиальным отличием нового поколения препаратов на основе иммобилизованных клеток является то, что внутри или на поверхности гранул присутствует субстрат — строго подобранные компоненты питания для микроорганизмов в оптимальных концентрациях. При хранении субстрат не покидает гранул и не используется клетками микроорганизмов, являющихся основой биопрепарата. При внесении препарата в торф, почву, минеральную вату концентрация консерванта резко снижается за счет его разбавления, гранулы начинают насыщаться кислородом воздуха и вне зависимости от того, сколько микроорганизмов осталось внутри или на поверхности, начинается их рост и проникновение в зону корневой системы. Клетки из гранул колонизируют окружающее пространство. Количество вышедших клеток (а, следовательно, объем занятого ими пространства) при применении иммобилизованных препаратов в первую очередь определяется наличием и количеством компонентов питания в гранулах.
Таким образом, одновременная иммобилизация клеток биопрепарата и компонентов питания для них позволяет:
- увеличить срок хранения клеток микроорганизмов;
- резко повысить концентрацию клеток в прикорневой зоне растения;
- обеспечить активность биопрепарата в течение нескольких месяцев после внесения.
Проведение исследования
Наши эксперименты показали, что при хранении препарата с микроорганизмами в иммобилизованной форме в течение года при комнатной температуре выход клеток в торфогрунты и минеральную вату практически не изменился. Клетки, вышедшие из одной гранулы размером около 0,1 мм, способны колонизировать до 100 мл субстрата. После внесения препаратов на основе иммобилизованных клеток присутствие микроорганизмов в свободном состоянии можно обнаруживать в течение трех месяцев и более.
Препараты на основе иммобилизованных клеток выглядят как расслаивающиеся эмульсии, осадок которых представляет едва заметные невооруженным глазом микрогранулы (0,1- 0,2 мм в диаметре), их окраска варьирует от белой до светло-желтой. Иммобилизованные препараты нельзя применять в системе капельного полива во избежание забивания капельниц. Препараты можно вносить через опрыскиватели при постоянном перемешивании со снятыми форсунками и фильтрами.