Биозащита
Перекись водорода - панацея или скрытая угроза?
18 августа 2020, 10:26
Журнал Гавриш №2. 2020
В статье проведено исследование влияния перекиси водорода на различные микроорганизмы, находящиеся в прикорневой зоне растения. Исследовано, как влияние на бактериальные культуры, так и на грибные. Исходя из результатов данного исследования выдвинута теория о том, что при внесении перекиси водорода в прикорневую зону растения нарушается устоявшийся биоценоз, что может привести к неоднозначным последствиям.
Перекись водорода
Перекись водорода и товарные продукты на ее основе, является, пожалуй, единственным химическим соединением окислителем, применение которого не сопровождается экологически вредными последствиями. Это обусловливает все больший интерес к применению ее в растениеводстве закрытого грунта как для стерилизации и обеззараживании различных поверхностей и конструкций, так и для прямого внесения растворов препарата при поливах, при этом одним из объяснений такого шага (внесение перекиси под корень растения) служит обогащение поливного раствора кислородом, что является не совсем корректным. По своим химическим свойствам перекись водорода уникальное соединение, оно может выступать как окислитель, так и восстановитель. Соответственно применение перекиси водорода при обработке прикорневой зоны, где могут одновременно протекать как окислительные, так и восстановительные процессы, должно быть очень осторожным и обдуманным, а еще лучше многократно проверенным. Кроме того, перекись водорода способна разрушаться с образованием активного кислорода, который также может являться агентом окисления органических и неорганических соединений. Катализатором данного процесса являются соли металлов, особенно двух и трех валентные.
Механизм воздействия перекиси водорода на микробные и грибные клетки достаточно сложен и до конца не изучен, это могут быть окислительно-восстановительные процессы и одновременно окисление свободным кислородом, но несомненно эффект от действия перекиси есть, и он многократно доказан.
Целью данной работы были исследования по действию перекиси водорода на различные группы микроорганизмов, находящиеся в разных фазах своего развития, а также находящихся как в планктонном состоянии, в виде отдельных клеток, так и в состоянии биопленок на биологических поверхностях. Под действие перекиси водорода при внесении ее с поливом попадают не только фитопатогенные микроорганизмы, но и микроорганизмы, входящие в состав биологических препаратов СЗР. Важно понимать к чему приведёт воздействие перекиси водорода на данные микроорганизмы, для того чтобы предположить реакцию сложившегося биоценоза микроорганизмов. В связи с этим в качестве объектов исследования были выбраны следующие микроорганизм: Fusarium oxysporum, Trichoderma viride, Bacillus subtillis, Pseudomonas fluorescens.
Проведение исследования
На первом этапе исследования были проведены эксперименты по изучению влияния перекиси водорода на свободные (планктонные) клетки микроорганизмов. Важным является не только действие перекиси водорода, но и её концентрация. В связи с этим для проведения исследований были выбраны концентрации перекиси водорода от 1.5% до 0,5%.
Микроорганизмы для исследований предоставлены коллекцией кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И.Менделеева.
Перед экспериментом каждый из микроорганизмов выращивали на жидкой питательной среде оптимальной для роста данного микроорганизма. Для грибных культур процесс культивирования останавливали в середине экспоненциальной фазы для минимизации содержания в суспензии клеток спор. Микроскопирование суспензии клеток подтверждало минимальное количество спор. Далее готовили исследуемый раствор перекиси водорода из 37% раствора и вносили в него соответствующий объем суспензии клеток, так, чтобы концентрация клеток в растворе составляла величину не более 10 КОЕ/ мл. Суспензию клеток в перекиси водорода помещали в термостат при температуре 27°С и через определенные интервалы времени отбирали пробы, которые сразу же разбавляли в стерильной дистиллированной воде 1000 раз для снижения концентрации перекиси водорода на микроорганизмы. Далее в полученной суспензии определяли концентрацию клеток с помощью метода последовательных разведений Коха. Таким образом были получены результаты по влиянию различных концентраций перекиси водорода на кинетику гибели различных микроорганизмов. Полученные данные приведены на рисунке 1:
Рисунок 1. Кинетика гибели, исследуемых клеток в 0,5% растворе перекиси водорода
Экспериментальные данные позволяют рассчитать удельную скорость гибели клеток при различных концентрациях перекиси водорода и что самое главное оценить как разные микроорганизмы выживают при одних и тех же концентрациях. Как видно, из графиков, все исследуемые микроорганизмы подвержены воздействию перекиси водорода и гибнут при контакте с ней. Но скорость гибели разных групп микроорганизмов различна. Наибольшей скоростью гибели в данных экспериментах обладают свободные (планктонные) клетки Pseudomonas fluorescens. Минимальное воздействие перекиси водорода наблюдали на Trichoderma viride. Оба микроорганизма являются стандартными представителями при формировании микробного биоценоза прикорневой зоны.
Полученные нами результаты хорошо согласуются с результатами по исследованию гибели клеток активного ила при обработке очищенной воды перекисью водорода [1].
Важным является то, что различные микроорганизмы имеют разную устойчивость к воздействию перекиси в планктонном состоянии. Так устойчивость клеток Bacillus subtilis много выше чем устойчивость Pseudomonas fluorescens в аналогичных условиях. Фитопатогенный гриб Fusarium oxysporum много менее устойчив чем штамм Trichoderma viride. Временной интервал проведения экспериментов не превышал 60 мин, что соответствовало реальному времени между поливами в теплицах.
Полученные результаты по воздействию перекиси водорода на планктонные (свободные) клетки могут отличатся в том случае, если речь идет о микроорганизмах, образующих биологические пленки различной природы. А в условиях развития микроорганизмов на корневой системе растения они практически всегда образуют пленки, покрытые как собственными секретируемыми биологическими полимерами, так и полимерами растительного происхождения. Большая устойчивость микробных биопленок, в сравнении с планктонными клетками, наблюдается повсеместно в медицинской практике. [2,3] анализ выживания клеток в биопленке крайне затруднен, и мы попытались качественно оценить устойчивость микроорганизмов, расположенных (выросших) на поверхности корневой системы растения, к перекиси водорода. Для этого были использована рассада ремонтантной земляники сорта Клери (рис. 2), выращенная в торфосмеси, в горшках объемом 0.5 литра.
Рисунок 2. Рассада ремонтантной земляники сорта Клери
Первоначально был определен состав и концентрация основных групп микроорганизмов в торфосмеси и проведена их первичная идентификация стандартными микробиологическими методами. Результаты исследований приведены в таблице 1.
Таблица 1. Результаты первичной идентификации микроорганизмов в торфосмеси
| Образец торфа | Trichoderma sp. | 4*10⁵ КОЕ/г |
| Alternaria sp. | 2,9*10³ КОЕ/г | |
| Fusarium sp. | 5*10⁴ КОЕ/г | |
| Mucor sp. | 1,2*10³ КОЕ/г | |
| Botrytis sp. | 6,8*10² КОЕ/г | |
| Aspergillus sp . | 7,2*10⁴ КОЕ/г | |
| Rhizopus sp. | 6*10² КОЕ/г | |
| Бактерии (Г+ и Г-) 10⁹ КОЕ/г | 8*10⁹ КОЕ/г |
Далее корневую систему насыщали растворами перекиси водорода различной концентрации и выдерживали равные интервалы времени. Далее корневую систему промывали объемом воды и вновь анализировали содержание и концентрацию микроорганизмов стандартными микробиологическими методами. Результаты исследований так же представлены в таблице 2.
Таблица 2. Изменение микробного биоценоза земляники выращенного на кокосовом субстрате при обработке различными концентрациями перекиси водорода
| Состав | Контроль | 0,5% H₂O₂ | 1% H₂O₂ | 1,5% H₂O₂ |
| Trichoderma sp. | Trichoderma sp. | Trichoderma sp. | Trichoderma sp. | |
| Alternaria sp. | Alternaria sp. | Alternaria sp. | - | |
| Fusarium sp. | Fusarium sp. | - | - | |
| Mucor sp. | Mucor sp. | Mucor sp. | - | |
| Botrytis sp. | - | - | - | |
| Aspergillus sp. | Aspergillus sp. | - | - | |
| Rhizopus sp. | Rhizopus sp. | - | - | |
| Бактерии (Г+ и Г-) 10⁹ КОЕ/г | Бактерии (Г+ и Г-) 10⁸ КОЕ/г | Бактерии Г+ 10⁸ КОЕ/г | Бактерии Г+ 10⁸ КОЕ/г |
Как видно из таблицы с увеличением концентрации перекиси водорода начинает меняться видовой состав как бактериальной, так и грибной составляющих, микробного биоценоза в торфосмеси. Так Alternaria sp. и Aspergillus sp. менее устойчивы чем остальные представители грибной флоры и практически не обнаруживаются уже при обработке 10 мин.1,5% раствором, а Fusarium sp. и Botrytis sp. не выдерживают обработки 0.5 % раствором, грибы рода Trichoderma sp., как и раньше, выдерживают повышенные концентрации перекиси водорода.
Бактериальная составляющая микробного ценоза меняется не так существенно при увеличении концентрации перекиси водорода, а общая концентрации бактерий снижается с 10⁹ КОЕ/г до 10⁸ КОЕ/г.
1. Штамм Е. В. и др. Биотестирование в оценке эффективности технологий очистки сточных вод //Водные ресурсы. – 2011. – Т. 38. – №. 2. – С. 232-238.
2. Стрелкова Е. А. и др. Роль внеклеточного полимерного матрикса в устойчивости бактериальных биопленок к экстремальным факторам среды //Микробиология. – 2013. – Т. 82. – №. 2. – С. 131-131.
3. Винник Ю. С. и др. Микробные биоплёнки в хирургии: механизмы образования, лекарственная устойчивость, пути решения проблемы //Новости хирургии. – 2010. – Т. 18. – №. 6.